抗新型冠状病毒肺炎药物靶点的研究进展
摘要：自2019 年底来，新型冠状病毒（）在国内爆发，并且目前已在日本和韩国等地进入高发态势，该病毒导致的新型冠状病毒肺炎（）已造成多人感染并有2 500 余人死亡，世界卫生组织于2020 年1 月31 日宣布疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”。抗新型冠状病毒药物是阻止病毒传播以及在宿主体内复制从而引起肺炎的有力武器。综述了抗COVID-19 药物靶点以及相应的药物和候选物的研究进展。
自2019 年12 月以来，新型冠状病毒（SARS- CoV-2 ）在全国多个地区快速传播，截止2020 年2 月23 日该病毒已导致全国感染77 000 余人，而国外其他地区感染人数已2 000 余人，该病毒导致的新型冠状病毒肺炎（）已导致2 500 余人死亡，全球多地进入疫情紧急状态。发现高效的抗药物以及用于SARS-CoV-2 治疗的策略迫在眉睫。
属于β 属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径为60 ～140 nm 。其基因特征与非典型肺炎冠状病毒（SARS- CoV ）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV ）有明显区别[1] 。SARS-CoV-2 病毒与以上两种病毒均属于正义、单链RNA 病毒，这3 种冠状病毒具有非常相似的生命周期。刺突糖蛋白（S 蛋白或spike 蛋白）的S1 亚基上的受体结合域（RBD ）与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2 （ACE2 ）之间的结合触发S 蛋白的S2 亚基发生构象变化，导致病毒通过内吞作用进入宿主细胞[2-3] 。此外，跨膜蛋白酶丝氨酸2 （TMPRSS2 ）可以将S 蛋白裂解为S1 和S2亚基，助推病毒在细胞表面以非内吞作用途径进入细胞[4] 。SARS-CoV-2病毒进入细胞后，核衣壳与病毒自身的正义链RNA释放到细胞质中，正义链RNA的开放阅读框ORF1a和ORF1b翻译产生非结构蛋白，由木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）和主蛋白酶（Mpro或3CLpro）参与裂解，最终产生包括螺旋酶（Helicase）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）在内的非结构蛋白，参与病毒转录、复制过程。最终由核衣壳蛋白和基因组RNA组装成新 的病毒体通过胞吐作用释放到细胞外[5]。在SARS-CoV-2跨膜进入宿主细胞的过程、在宿主细胞内的转录翻译、新病毒体的组装、释放过程中的关键蛋白均可作为抗SARS-CoV-2药物研发的靶点。本文以SARS-CoV-2感染宿主的生命周期为主线，综述了抗SARS-CoV-2药物靶点以及针对靶点的药物研究状况。
1 阻止病毒进入宿主细胞的抗病毒药物靶点
阻断通过内吞作用进入宿主细胞的过程，该过程涉及的药物靶点有来自宿主的ACE2 蛋白、TMPRSS2 和AAK1 ，以及来自SARS- CoV-2 的S 蛋白。
ACE2 广泛分布在人体各组织，尤其在肺部含量较高。动物实验表明ACE2 具有保护小鼠免受酸吸入或脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征[6] 。SARS 病毒感染时，ACE2 的水平明显下降[7] 。武汉病毒研究所的一项研究证实ACE2 受体蛋白对于新型冠状病毒感染细胞是必需的[8] 。与ACE2 蛋白受体直接作用的区域内存在大量非保守 性突变。目前，S蛋白-ACE2相互作用的蛋白结构已经得到解析，为疫苗和药物设计提供可靠的指导[9]。针对SARS-CoV-2 进入宿主细胞所必须的S 蛋白与ACE2 蛋白相互作用，已有多个国内研究团队通过分子对接虚拟筛选方法以及人工智能药物筛选的方法发现了多种潜在的ACE2 结合剂，但目前暂未见到这些分子的活性试验数据。SARS-CoV-2 与的S 蛋白序列相似度为76% ，通过蛋白S1 区域内的RBD 与ACE2 蛋白结合。griffithsin 是一种源自红藻的凝集素，可与病毒糖蛋白表面上的寡糖结合，已处于Ⅰ期临床研究用于预防HIV-1 感染，但是否可作为SARS-CoV-2S 蛋白抑制剂亟待验证[10] 。萘莫司他在血液透析中被用作抗凝血剂，是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，已被证明可通过阻止膜融合抑制SARS-CoV-2 感染，半最大效应浓度（EC 50 ）为22.50 µmol/L ）[11] ，猜测起作用可能与TMPRSS2 有关。SARS-CoV-2 是经由肺部AT2 肺泡上皮细胞的ACE2 受体通过内吞作用感染细胞的，而AAK1 是这个过程调节器；阻断AAK1 则有可能阻断病毒进入细胞过程。2020 年2 月4 日Benevolent AI 公司报道，借助深度学习和知识图谱发现378 种AAK1 潜在阻断剂，其中有47 种具有医学用途；这些药物中有很多和肿瘤治疗相关，如舒尼替尼、厄洛替尼等。这两种药物都通过抑制AAK1 体现了对病毒感染的抑制作用[5] 。
2 阻断SARS-CoV-2RNA复制过程的药物靶点
作为RNA 病毒，病毒自身编码的RNA 依赖性RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase ，RdRp ）对病毒的RNA 复制起关键作用，RdRp 抑制剂可作为抗RNA 病毒的广谱抗病毒药物。RdRp 蛋白结构中有一个大而深的凹槽结构区作为RNA 合成的活性中心。与的RdRp 蛋白序列相似性高达96% ，而且结构中的不同之处均存在于活性中心以外。因此，高的序列保守性使得针对SARS 病毒RdRp 抑制剂的开发经验可以应用到抗新冠状病毒药物的研发中[12] 。
利巴韦林、法匹拉韦是目前已上市的病毒RdRp抑制剂。体外研究结果显示Vero E6细胞模型中，利巴韦林抗SARS-CoV-2病毒的EC 50 为109.50 µmol/L，细胞半数毒性浓度（CC 50 ）大于400 µmol/L ，选择性指数（SI ）大于3.65 ，活性较弱；法匹拉韦的EC 50 为61.88 µmol/L ，CC 50 大于400 µmol/L ，SI 大于6.46 。而之前关于埃博拉病毒的研究显示，法匹那韦虽然在体外研究中EC 50 为67 µmol/L ，但却在动物研究中能够100% 的保护小鼠抵抗埃博拉病毒的感染， 因此值得进一步研究[11]。评估法匹拉韦联用干扰素-α的用法正在国内进行Ⅲ期临床研究。此外，瑞德西韦作为一种腺嘌呤衍生物的前药，体外实验显示对MERS-CoV 、等RNA 病毒具有广谱的 抗病毒活性，在Vero E6细胞中的EC 50 为0.77 µmol/L；2020 年2 月初在国内启动的两项III 期临床试验旨在评估针对患者的瑞德西韦静脉注射，估计完成日期为2020 年4 月。加利地韦也是一种RNA 聚合酶抑制剂，目前正处于Ⅰ期临床研究预期用于埃博拉、寨卡病毒的治疗等；临床前研究显示对MERS-CoV 、SARS-CoV 在内的许多RNA 病毒具有抑制活性。
与的解旋酶即非结构蛋白13 （nsp13 ），利用ATP 提供的能量水解核苷酸，解旋核酸双链，速率可达到280 个碱基对/s ，其活性依赖于镁离子，而RdRp 可以增强解旋酶活性[13] 。2014 年密苏里大学的研究人员报道SSYA10-001对SARS-CoV解旋酶的IC 50 为5.9 µmol/L，在VeroE6细胞模型中抑制MERS-CoV、SARS-CoV的EC 50 分别为约25 、7 µmol/L，对SARS-CoV 病毒的显现出一定的抑制活性[14] 。
3 阻断SARS-CoV-2病毒蛋白生成的药物靶点
在病毒进入人体细胞后释放出的RNA 直接与宿主的核糖体结合，翻译出的病毒复制所需的蛋白酶。已知的3 个关键蛋白酶分别为3CLpro 、PLpro [15] 和RNA 解旋酶，目前均是抗病毒的重要药物靶点。
与3CLpro 不同，与SARS-nCoV 的PLpro 只具有83% 的序列相似性[12] 。但是形成活性位点的蛋白质高级结构在两个PLpro 蛋白中并没有发生变化[5] 。因此，针对病毒的PLpro 开发的抑制剂可能也适用于SARS-CoV-2 [7] 。国内已有团队通过虚拟筛选的方法找到PLpro 潜在抑制剂，但目前均未得到实验证实。有报道显示在体外实验中双硫仑是MERS-CoV 、SARS-CoV 中PLpro 的 慢结合竞争性抑制剂，因此也具有抑制SARS- CoV-2病毒PLpro 的潜在价值[16] 。GRL-0617 是一个合成小分子PLpro 抑制剂，在抗SARS-CoV 病毒的Vero E6显示IC 50 、EC 50 和CC 50 值分别为0.35、9.5和＞100nmol/L；在HEK293细胞中的CC 50 值大于100nmol/L[17] 。Lee 等[18] 通过高通量筛选与分子模拟结合，从30 000 个化合物中筛选得到MERS- CoV 病毒的PLpro 抑制剂，最优化合物的活性IC 50 达到 （20.0±2.8）μmol/L。这些化合物均可作为SARS- CoV-2PLpro 抑制剂进一步研究。
4 作用于其他环节的抗病毒药物靶点
除了与以上生命周期相关的抗病毒药物靶点以外，其他一些抗RNA 病毒的药物靶点也显现出作为抗SARS-CoV-2 药物靶点的潜力。
前期病毒的研究显示在病毒mRNAs cap甲基化是病毒逃避免疫系统的关键环节。非结构蛋白10 、16 （nsp16 、nsp10 ）共同参与这一甲基化过程，nsp16 为甲基转移酶（2'- O -MTase ）的主体，介导2'- O - 核糖甲基化到病毒mRNAs 的5'-cap 结构。nsp10 具有激活因子的作用，帮助nsp16 结合甲基供体分子SAM 和“加帽”的RNA 底物，底物SAM 结合口袋为抗病毒药物开发提供机会。目前，nsp16 、nsp10 复合物晶体结构已经得到解析，尚未有该方面的分子报道[19] 。
2019 年王冬音[20] 的研究显示穿心莲中主要成分穿心莲内酯通过干扰肠道病毒71 （EV-71 ）内涵体的酸化成熟过程，抑制病毒脱壳，从而使能进行有效复制的病毒减少，起到抑制病毒的作用；并且发现对EV-D68 病毒原型株和流行株均有显著的抑制作用，说明该机制存在一定普适性。沈阳药科大学课题组通过计算机虚拟筛选研究显示，穿心莲内酯对S 蛋白酶切位点也有很高的亲和力。穿心莲内酯作为抗菌抗病毒药物已使用多年，其抗SARS- CoV-2 病毒活性值得深入研究。
以上研究为抗药物以及抗其他RNA 病毒药物的研发提供新的思路。
5 结语
在引发的疫情快速传播的两个月以来，已有多个药物以增加适应症的方式开展抗SARS-CoV-2 的临床研究，以氯喹/ 羟氯喹、瑞德西韦和阿比多尔为代表的化合物已经展现出一定的治疗价值。并且有多个已上市的药物作为候选药物在进行体外和体内的抗SARS-CoV-2 研究，期望发现更加高效的抗病毒药物。本文综述了近期文献中报道的抗SARS-CoV-2 药物靶点以及抗病毒化合物，期望为该类抗病毒药物研究提供参考。
